原位杂交仪 原位杂交技术常用检测项目

原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(ISH),是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术。原位杂交仪使用标记的DNA或RNA探针,在原位检测组织、细胞中存在的特定并且正在表达的核酸序列(基因)的方法。80年代初,放射性同位素标记探针的被大量应用。而自1988年,以地高辛(dioxigenin, DIG)配体为主体的DIG检测系统问世以来,非同位素标记的原位杂交探针以其分辨敏感性高,耗时少,已成为原位杂交技术的重要标记手段。DIG检测系统使用地高辛(DIG)标记的探针与目标核苷酸序列结合,再应用HRP标记的抗地高辛抗体通过免疫组织化学方法在目标核酸原位形成带颜色的杂交信号,特异性地显示细胞中特定的DNA或RNA。一、原位杂交技术在临床病理诊断中的应用;(一)EBER原位杂交检测。EB病毒属疱疹科病毒,是一种人类特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒。通过密切接触传播,侵入门户通常为咽部的淋巴样组织,主要侵犯B淋巴细胞。EBER是EB病毒编码的小RNA,在EB病毒感染的细胞核中高拷贝存在。EB病毒的感染与鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、传染性单核细胞增多症等多种疾病相关。EBER在鼻咽癌几乎100%肿瘤细胞核呈阳性,结外NK/T细胞淋巴瘤(鼻型)理论上100%阳性,多数慢性炎性相关弥漫大B细胞淋巴瘤显示阳性,浆母细胞淋巴瘤阳性率为60~75%,霍奇金淋巴瘤阳性。(二)HPV原位杂交检测。人类乳头瘤病毒(HPV)是一种嗜上皮性病毒,在人和动物中分布广泛。原位杂交仪目前已经确定的HPV型别大约有100余种,依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危型和高危型HPV,低危型包括HPV6、11、42、43、44等型别,常引起外生殖器湿疣等良性病变,高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别,与宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN II/III)的发生相关,尤其是HPV16和18型。二、原位杂交检测操作流程(一)原位杂交操作流程:1、石蜡包埋组织切片,切片厚度4-6μm切片,防脱载玻片贴片;2、烤片 60℃ 2-16小时;3、新鲜二甲苯脱蜡 2×10分钟;4、100%乙醇后空气干燥 5分钟;5、胃蛋白酶消化,37℃孵育 30分钟;6、弃去胃酶工作液,去离子水冲洗3×1分钟,逐级酒精脱水、空气干燥 3×1分钟;7、10-20μl探针/切片,加盖玻片, 37℃杂交2~4小时或过夜;8、切片插入PBS缓冲液中以便去掉盖玻片 10分钟;9、PBS缓冲液洗 3×2分钟;10、滴加杂交后洗液,37℃孵育15分钟;11、PBS缓冲液冲洗2分钟×3次;12、切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,37℃孵育30分钟;13、PBS缓冲液冲洗2分钟×3次;14、去离子水冲洗后,滴加DAB工作液,孵育 5-15分钟;15、弃去显色液,去离子水冲洗,苏木素复染,脱水、透明、封片。(二)HPV-DNA原位杂交操作流程:1、石蜡包埋组织切片,切片厚度4-6μm切片,防脱载玻片贴片;2、烤片 60℃ 2-16小时;3、新鲜二甲苯脱蜡 2×10分钟;4、100%乙醇后空气干燥 5分钟;5、胃蛋白酶消化,37℃孵育 30分钟;6、弃去胃酶工作液,去离子水冲洗3×1分钟,逐级酒精脱水、空气干燥 3×1分钟;7、10-20μl探针/切片,加盖玻片;8、原位杂交仪中95℃变性5~8分钟,37℃杂交2~4小时或过夜;9、切片插入PBS缓冲液中以便去掉盖玻片;10、滴加杂交后洗液,37℃孵育15分钟;11、PBS缓冲液冲洗2分钟×3次;12、切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,37℃孵育30分钟 ;13、PBS缓冲液冲洗1分钟×3次;14、去离子水冲洗后,每张切片加入适量的DAB工作液,孵育   5-15分钟;15、弃去显色液,去离子水冲洗,苏木素复染,脱水、透明、封片。三、影响原味杂交检测质量的几个关键因素。(一)组织固定脱水的质量:固定不及时或固定不足导致细胞核酸断裂蛋白质自溶,胃酶消化后组织细胞结构模糊,原位杂交检测结果不能判读或假阴性。组织脱水不良有可能引起强烈的非特异性背景染色。(二)胃蛋白酶消化的质量:胃蛋白酶消化不足将影响探针与目标核酸杂交的结合程度,引起阳性减弱或假阴性等检测结果。(三)变性、杂交的温度与时间:在杂交变性过程中,特别是DNA变性杂交温度必须达到预设温度,变性温度过低导致DNA双链不能打开,探针不能与目标DNA结合,出现假阴性检测结果。(四)原位杂交操作流程的规范性:在检测过程中的干片、未使用杂交洗液、PBS清洗不足、DAB显色时间过长等因素有可能引起组织内非特异性背景染色。

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