原位杂交仪厂家 原位杂交的实验原理

原位杂交可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,原位杂交仪厂家然后将滤膜上的菌落裂解以释放DNA。将DNA烘干固定于膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。组织原位杂交简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需要裂解细菌释放DNA,然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。注意事项:1、固定液的选择及固定时间。石蜡组织建议用10%中性缓冲福尔马林固定6~48h,其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。组织离体后应尽快固定,建议在标本离体后30min内固定。如样本固定不及时,荧光信号会减弱。固定液的体积是组织体积的4~20倍,否则固定不充分,容易出现无信号或者信号很弱的现象。而且,为了保证信号的准确性,蜡块最好在2年内进行检测,已经切好的切片在6周内检测最佳。2、组织切片和载玻片的选择。组织切片4~5μm 厚,过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响,而且切片应完整,质量良好,否则会在预处理时掉片。载玻片的选择建议使用防脱载玻片,有条件的实验室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片,可有效防止脱片现象的发生。3、实验过程中切片的预处理。切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。当组织处理不规范、切片过厚或烤片不足时,在煮沸过程中容易掉片,建议烤片温度在56℃过夜。煮沸过程中要严格控制实验温度和时间。酶消化是 FISH 实验的关键步骤之一,如果对组织不熟悉,可以先消化推荐的反应时间,然后复染 DAPI在荧光显微镜下观察,在DAPI通道下,以细胞既无空洞(消化过度),亦无明显的云雾状(消化不足)为最佳,同时可切换观察红绿通道,以红绿通道无明显的背景为佳,如果背景较高,可适当延长消化时间。另外,对于陈旧的石蜡组织切片,要适当延长消化时间,否则会出现大量的自发荧光。4、变性和杂交。变性和杂交是本实验最关键的步骤,变性的时间和温度是杂交成功是否的关键,为保证变性期间温度的稳定,作者建议采用专业的原位杂交仪进行变性和杂交步骤,不仅能够减少实验的繁琐性,而且更有利于实验条件的控制,比如时间、温度和避光条件等。为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失和防止干片,原位杂交仪厂家一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。杂交后洗涤温度、时间和封片保存杂交后的洗涤对于整个实验结果的影响非常重要,首先应保证正确配置杂交洗涤液,洗涤液温度偏高或时间过长,可导致信号减弱,洗涤液温度偏低或者时间过短,会产生杂信号过多、红绿信号对比性差或者特异性低等情况。在复染完 DAPI 以后,加盖盖玻片,用指甲油固定住盖玻片四角,这样可以防止在油镜下观察时盖玻片脱落。由于荧光信号容易淬灭,所以在染色后应立即观察,如果当时不能观察,可将切片放入切片盒中,保存于-20℃冰箱里2周以内。 设置对照每次实验需设置标准对照: 实验室在每一轮检测中均应使用标准化对照材料( 阳性、阴性和可疑)。如果对照材料没有显示预期的结果,则不能对结果做出判定。5、结果判读。应选择细胞核大小一致、核边界完整、DAPI染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润性癌细胞核中的双色信号。判读标准参考《乳腺癌 HER-2检测指南(2014版)》,对于FISH结果不确定的病例,需要再计算20个细胞核中的信号或由另外一位病理诊断医师重新计数。如仍为临界值,则应行免疫组化检测(若FISH检测前未行),也可以选取不同的组织块重新检测。


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