原位杂交仪实验要求与步骤

在原位杂交和FISH实验中,变性温度是至关重要的环节,也是确保实验成功的关键步骤。原位杂交仪原位杂交仪可以根据实验者的设置,自动完成变性和杂交过程。在严格的温度控制,适宜的湿度环境下,加上低廉的成本,和时间上的节省,为分子水平的研究提供了可靠的保证。

原位杂交仪系统一次可处理12张玻片。全密封式上盖设计和全自动的加湿方法保证了理想的温度和湿度,系统保证了高度的温度均一性,使得所有玻片温差上下不超过土1 ℃。玻片很容易用手取出或放入。利用触摸屏可以简单快速的编辑99个用户定义方案和4种操作模式:变性/杂交、杂交和固定温度以及自定义模式。

原位杂交组织(或细胞)化学  简称原位杂交,属于固相分子杂交的范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。

根据探针的标记物是否直接被检测,原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针,zui后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

原位杂交zui初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记(如35S,3H,32P等)仍然广泛使用,但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针),更引起科技工作者的极大兴趣。

一、基本要求:1.  组织取材:组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快,所以新鲜组织和培养细胞zui好在30 min 内固定。2.  固定目的是:(1)保持细胞结构;(2)zui大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平;(3)使探针易于进入细胞或组织。

最常用的固定剂是多聚甲醛,与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同,多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,因而不会影响探针穿透入细胞或组织。3.  增强组织的通透性和核酸探针的穿透性:(1)稀酸处理和酸酐处理:为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合,以降低背景,杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min,经乙酸酐处理后,组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min,稀酸能使碱性蛋白变性,结合蛋白酶消化,容易将碱性蛋白移除。(2)去污剂处理:去污剂处理的目的是增加组织的通透性,利于杂交探针进入组织细胞,zui常应用的去污剂是Triton X-100。注意:过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构,而且还会引起靶核酸的丢失。(3) 蛋白酶处理:蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露,以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K),还有链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。4.  杂交缓冲液孵育:杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2 hr,以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点,达到减低背景的目的。5.  防止污染:由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶,为防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套,实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤(180℃)以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。6.  双链DNA探针和靶DNA的变性:杂交反应进行时,探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链DNA探针进行杂交(包括检测RNA时),双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应,不然解链的探针又会重新复性。

杂交液:杂交液内除含一定浓度的标记探针外,还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、原位杂交仪牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加,可以减低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm降低,杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA:RNA,RNA:DNA,DNA:DNA的杂交温度降低0.35℃,0.5℃和0.65℃。

所以,杂交液中加入适量的甲酰胺,可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合,从而减少杂交液的有效容积,提高探针有效浓度,以达到提高杂交率的目的(尤其对双链核酸探针)。在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等,都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合,以减低背景。

探针的浓度: 探针浓度依其种类和实验要求略有不同,一般为0.5~5.0 μg/ml(0.5~5.0 ng/μl)。zui适宜的探针浓度要通过实验才能确定。探针的长度: 一般应在50-300个碱基之间,zui长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞,杂交率高,杂交时间短。


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