原位杂交仪厂家可以根据实验者的设置自动完成变性和杂交过程

原位杂交组织(或细胞)化学 简称原位杂交,属于固相分子杂交的范畴,原位杂交仪厂家它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否直接被检测,原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针,最后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记(如35S,3H,32P等)仍然广泛使用,但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针),更引起科技工作者的极大兴趣。

一、基本要求:1.  组织取材:组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快,所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。

2.  固定目的是:(1)保持细胞结构;(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平;(3)使探针易于进入细胞或组织。最常用的固定剂是多聚甲醛,与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同,多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,因而不会影响探针穿透入细胞或组织。

3.  增强组织的通透性和核酸探针的穿透性:(1)稀酸处理和酸酐处理:为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合,以降低背景,杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min,经乙酸酐处理后,组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min,稀酸能使碱性蛋白变性,结合蛋白酶消化,容易将碱性蛋白移除。(2)去污剂处理:去污剂处理的目的是增加组织的通透性,利于杂交探针进入组织细胞,最常应用的去污剂是Triton X-100。注意:过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构,而且还会引起靶核酸的丢失。(3) 蛋白酶处理:蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露,以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K),还有链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。

4.  杂交缓冲液孵育:杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2 hr,原位杂交仪厂家以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点,达到减低背景的目的。

5.  防止污染:由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶,为防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套,实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤(180℃)以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。6.  双链DNA探针和靶DNA的变性:杂交反应进行时,探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链DNA探针进行杂交(包括检测RNA时),双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应,不然解链的探针又会重新复性。

原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。所谓原位即指标本上DNA原位变性,在利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针杂交后,通过放射自显影或非放射性检测体系来检测染色体上特异DNA或RNA顺序,可用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强弱来确定探针的位置,从而进行准确的基因定位。表明用此法将胰岛素基因定位于11p15.但原位杂交必须在已知探针的情况下方可进行,而在未知致病基因时,则无法进行基因定位医学`教育网搜集整理。

放射性同位素标记核酸探针与染色体显带结合进行原位杂交仍有不少缺点和局限性。例如需要使用放射性同位素的特殊实验室,自显影曝光时间长,同位素标记的探针不易保存,放射污染不利健康,特别是高质量的中期染色体标本在细胞培养基础上难以得到,观察费时,对间期核的研究难以进行等。


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