原位杂交仪的特点

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。原位杂交仪用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高,可以通过延长曝光时间加强信号强度,故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足,这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系,具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定,一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列,其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

FISH检测范围的扩大,使得FISH技术的应用在20 世纪90 年代急速增长。由FISH技术应用而形成的分支技术实现了越来越多的不同类型位点同时检测。首先是采用不同的荧光素来检测多位点,如双色荧光用于检测特异的核酸序列,每一条染色体、基因或者转录产物分别由一种可以分辨的荧光信号来表示。之后是采用两种色彩译码方案进一步扩大了FISH应用范围。译码方案主要是针对色彩比例,即每一种颜色在总颜色中所占的比例来描绘多位点。前述的每一种方法,或是两种方法的结合都已经将可检测位点多达12个。采用计算机翻译的五色方案可同时检测出人类所有染色体代表着FISH 技术多位点检测的里程碑。尽管可以采用多种方法观测到mRNAs,但是FISH对整个转录产物的原位分析似乎更有应用前景。色彩译码技术已经实现了对整个组织的检测。 Pinkel 等(1986)首次将荧光图像定量分析用于基本细胞遗传检测,采用双色激发块装置照相机检测荧光信号,而且定量分析技术很快用于了mRNA检测。荧光检测的关键是信号的重现性、无规律性及背景的自发荧光。不仅不同的样品之间荧光不同,而且同一载玻片上的材料或者同样的细胞都有可能显示出不均衡的荧光。目前已有多种方法用于消除一些组织中的自发荧光:如样品制备过程中,采用的消除自发荧光试剂包括硼氢化钠或者采用光照辐射进行预处理以消除非特异性背景信号。这些消除自发荧光的方法并不完全有效,通常在进行图像分析时通过计算机算术除去自发荧光信号。荧光图像的光谱数据包括真正的信号和许多杂噪,分别进行分析并且通过单独的光谱组分分析除掉杂噪数据。多色FISH 有自身的限制,包括不同的荧光强度和颜色重叠。但是通过计算机算法分析平衡了多色图像,包括强度变化和自动纠正信号重叠。

FISH图像自身的限制并没有影响到自动破译算法的发展。采用序列较大探针进行DNA位点检测和多色荧光计数算法辅助病理学家实现了自动化分析。此外,检测探针试剂盒和点计数方法的应用为便捷的检测结果提供了一个平台。尽管多种方法已经用于分析或优化自动细胞检测系统,人工的细胞病理检测仍是可信度高的组织分析方法。原位杂交仪然而,细胞制备、鉴别、固定介质上细胞样品计算机化检测在未来的医学诊断中的高效益性不容忽视,快速检测细胞内的分子信号只有通过计算机辅助方法进行检测。现在,自动化检测程序已经扩展到采用多基因转录模型检测特异的DNA 簇和转录位点以确定功能细胞的状态。 鉴于FISH起始阶段的发展主要是探针类型和检测位点的扩展,荧光检测技术将来的发展可能包括检测领域的扩展。荧光图像临床诊断应用需要在检测体系上进一步提高,如探针的结合,照相和分析的自动化,因此避免了不同操作间的误差。样品厚度是荧光显微镜检测样品类型的一个限制因素。近来的激光共聚焦显微镜和光学X射线断层摄影技术要求样品厚度达到1~2mm。一种改进的光学投射X 显微断层摄影技术可以获取到15mm 厚样品的图像扩大了生物学和诊断样品的检测范围。活细胞的RNAs FISH技术检测也有报道。既可以采用体内释放的荧光集团也可以采用杂交后探针的荧光素进行检测。这两种新方法都可以降低非特异性标记探针存在时的高背景(如活细胞),可以用于追踪mRNA的合成和转移途径。这些方法较绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein, GFP)更易于检测不同靶分子。相对于GFP活细胞原位杂交检测,FISH易受到细胞内合成探针的影响。FISH 需要进一步的改进以降低活体基因表达检测时的干扰背景,避免细胞内自身杂交物的干扰。其实完全可以不必考虑FISH 检测和荧光检测蛋白技术的差异,将FISH技术和荧光蛋白技术结合起来可以同时检测目的核酸和蛋白。


除非注明,发表在“原位杂交仪”的中药二氧化硫检测仪『二氧化硫检测仪(四联)』版权归原位杂交仪_admin所有。 转载请注明出处为“本文转载于『原位杂交仪』原地址http://lygznh.com/post/289.html