原位杂交仪实验操作步骤

原位杂交技术自创立以来,为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病理学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料,发挥了其他技术难以取代的作用。但不论是使用放射性核素探针,还是非放射性探针,大部分研究工作都还限于光镜水平。为了对检测的靶核酸进行更精确的亚细胞定位,以及能观察含靶核酸序列细胞的超微结构,人们便将原位杂交与电镜技术相结合,使原位杂交从光镜水平延伸到电镜水平。

根据杂交反应是在组织包埋前进行、包埋后进行还是在不经包埋的细胞、原位杂交仪染色体整体标本或冷冻超薄切片上进行,电镜原位杂交技术大体上可分为包埋前、包埋后和不包埋三类。其中以包埋后法制片比较容易,应用较广泛。

包埋后电镜原位杂交的特点是杂交反应在电镜包埋后的超薄切片上进行。这一技术能否成功的关键取决于电镜包埋过程是否能把细胞中的靶核酸保留在它们原来所在的亚细胞结构上。一般认为,常规的包埋剂(疏水性树脂)不适用于包埋后原位杂交。如环氧树脂,需要在较高的温度下(60~C)经48小时才能聚合,长时间的高温包埋过程会影响组织内核酸的保留,而且树脂的疏水性也不利于在亲水条件下进行的杂交反应。包埋后原位杂交常用的包埋剂都是亲水性树脂,如Lowicryl K4M、比乙二醇甲基丙烯酸酯及LR White等。

由于铜可能与以后使用的某些试剂发生化学反应,故超薄切片应载于镍网或金网上而不能载于铜网上。在超薄切片上进行原位杂交的基本步骤与光镜原位杂交类似.但杂交前一般不用蛋白酶K、去污剂或酸类处理,或用低浓度的去污剂短时间处理,但可用预杂交液减弱背景。将载网漂浮在蜡膜上的液滴上进行反应和洗涤。包埋前法是在冷冻或振动切片上先行原位杂交,然后作电镜包埋和超薄切片。包埋前法可与光镜原位杂交检测相连续.易获得阳性结果,但超微结构损伤较严重,且细胞膜可阻碍探针进入靶位。不包埋法在冷冻超薄切片上进行,但冷冻超薄切片技术要求高,费用大,尚难以普及。

原位杂交组织(或细胞)化学技术简称原位杂交(In situ hybridization),如上所述,属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA,然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段,而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交,确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时,Buongiorno– Nardelli和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位,从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交,首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位,但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞,探针均采用同位素标记。

由于同位素标记探针具有放射性既污染环境,又对人体有害,且受半衰期限制等缺点,科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交,然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)报道用2,4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针,使该DNA探针具有抗原性,然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针,zui后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用,但因敏感度不够高,应用不够普遍。 Pezzella(1987)创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法,其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化,利用单克隆抗体识别磺基化探针,再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体,从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便,不需作缺口平移标记,原位杂交仪敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后,已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat(1983)首先建立的,它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA,通过生物素与抗生物素结合,过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用,特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术,该技术是用光敏生物素(Photobiotin)标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素,它们都是由三个部分组成:光敏基团、连结臂和生物素(图20-1)。在强光下,不需酶反应,光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸,方法简单,灵敏度也不低,但标记效率不高,每100~150个碱基才能标记一个生物素,对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用,以免因标记数过少而影响灵敏度


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