原位杂交仪厂家以及技术应用

 NAI7000原位杂交技术以来的30年内,该技术在各个领域得到了广泛应用。但在大部分的研究工作中,杂交信号都是用光学显微镜进行观察并记录的,这样在分辨率上就存在很大的限制,为了对检测的特异核酸进行更精确的亚细胞定位,以便将组织、细胞和染色体等水平上DNA或RNA定位与超微结构相互联系起来,许多学者就试图将其与电镜组织化学技术相结合,并由此建立了电镜原位分子杂交技术。

原位分子杂交技术的分类

1.2.1依标记物的不同分类:

原位杂交技术依据其标记物的不同可分为电镜放射性原位杂交技术和电镜非放射性原位杂交技术。

原位杂交技术应用放射性同位素作为标记,原位杂交仪厂家具有敏感性高,标记物不会干扰杂交反应,并且结果适合于进行定量分析等特点。常用的几种放射性同位素:3H,35S,125I和32P都已经被用于电镜原位杂交,但各有优缺点,目前应用最广泛的放射性标记物是35S。

原位杂交技术由于无放射性污染,不需耗时较长的放射自显影过程,其杂交信号的亚细胞定位甚至比同位素探针好,因此目前已有取代放射性原位杂交技术的趋势。其中地高辛标记的探针具有操作简便、灵敏度高、背景低等特点,已成为目前应用最广泛的标记物。

1.2.2按操作程序的不同分类:

原位杂交技术的操作程序,它可分为包埋前电镜原位杂交,包埋后电镜原位杂交和不包埋电镜原位杂交3种。它们也各有优缺点:

原位杂交技术能最大程度地保存细胞和细胞中的核酸含量,杂交信号也比较强,但冷冻过程会在一定程度上损害细胞的超微结构;包埋前电镜原位杂交技术操作比较容易掌握,杂交反应不受电镜包埋过程的影响,细胞的超微结构也比较清晰。缺点是反应产物大小难以控制,大量反应产物有时会掩盖准确的超微结构定位;包埋后原位杂交技术在原位杂交前的电镜生物样品处理过程中,核酸降解量较多,因此只适合于核酸含量较多的细胞和组织。

2.原位分子杂交技术的基本操作程序

本文只以非放射性原位杂交技术为例介绍电镜原位杂交技术的基本操作程序。

2.1材料的固定

在原位杂交中,要获得清晰完整的超微结构图像,最大限度地保持细胞内的DNA或RNA分子的完整性,使探针容易进入细胞或组织,选择合适的固定剂及固定时间对新鲜的组织迅速固定是至关重要的。

常用的固定剂如戊二醛,原位杂交仪厂家甲醛等交联性固定剂能较好地保持细胞和组织的超微结构,也能有效地保存组织细胞中的核酸,但它们会和细胞浆内的生物大分子产生交联,影响探针的穿透力。而多聚甲醛等非交联性固定剂显然对探针具有很好的穿透性,但对核酸及超微结构的保存却较差。因此在实验中应试用不同的固定剂或它们的组合,以探求最合适的固定条件。现在文献中一般多推荐使用4%的多聚甲醛加0.5%的戊二醛作为固定液。

至于固定时间一般认为以2~4h为宜。固定的时间过长会影响探针的的穿透力,减小杂交率;过短,则会对超微结构产生危害。Jing Y等对鼠肾样品进行不同时间的固定,发现固定4h的样品可以达到杂交信号和超微结构保存的最佳结合。

2.2包埋

常规的树脂包埋由于需要高温聚合等处理程序,组织内的核酸可能全部或部分遭到破坏,影响实验结果。因此,在电镜原位杂交技术方面要求采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等,后者需要配备冰冻超薄切片机,且技术难度较大,一般较少使用。目前使用较为广泛的低温包埋剂多为乙烯系化合物,如乙二醇甲基丙烯酸酯,Lowicryls,LR White等,其中又以Lowicryls使用最为广泛。


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